3.4.2 柠檬酸发酵微生物
1) 黑曲霉（Aspergillus niger）的形态特征
目前生产上常用产酸能力强的黑曲霉作为生产菌。在固体培养基上，菌落由白色逐渐变至棕色。孢子区域为黑色，菌落呈绒毛状，边缘不整齐。菌丝有隔膜和分枝，是多细胞的菌丝体，无色或有色，有足细胞，顶囊生成一层或两层小梗，小梗顶端产生一串串分生孢子。
2) 黑曲霉（Aspergillus niger）的生理特征
黑曲霉生产菌可在薯干粉、玉米粉、可溶性淀粉糖蜜、葡萄糖麦芽糖、糊精、乳糖等培养基上生长、产酸。黑曲霉生长适pH值因菌种而异，一般为pH3~7；产酸适pH为1.8~2.5。生长适温度为33~37℃，产酸适温度在28~37℃，温度过高易形成杂酸，斜面培养要求在麦芽汁40Be′左右的培养基上。黑曲霉以无性生殖的形式繁殖，具有多种活力较强的酶系，能力用淀粉类物质，并且对蛋白质、单宁、纤维素、果胶等具有一定的分解能力。黑曲霉可以边长菌、边糖化、边发酵产酸的方式生产柠檬酸。
3.4.3 柠檬酸发酵机理
关于柠檬酸发酵的机制虽有多种理论，但目前大多数学者认为它与三羧酸循环有密切的关系。糖经糖酵解途径(EMP途径)，形成丙酮酸，丙酮酸羧化形成C4化合物，丙酮酸脱羧形成C2化合物，两者缩合形成柠檬酸（见发酵代谢）。
3.4.4 柠檬酸发酵用原料
柠檬酸发酵的原料有糖质原料(甘煎废糖蜜、甜菜废糖蜜)、淀粉质原料(主要是番薯、马铃薯、木薯等)和正烷烃类原料三大类。
3.4.5 柠檬酸发酵工艺
1) 试管斜面菌种培养
察氏琼脂培养基：NaNO3 3g， 蔗糖20g， K2HPO4 1g， KCl 0.5g， MgSO4.7 H2O 0.5g， FeSO4 0.01g， 琼脂20g， 用水定溶至1000ml， pH自然。
察氏-多氏琼脂培养基：蔗糖30g，NaNO3 2g， MgSO4.7H2O 0.5g， KH2PO4 1g， KCl 0.5g， FeSO4.7H2O 0.01g， 溴甲分绿0.4g，琼脂20g， 蒸馏水1000ml， pH自然。
蔗糖合成琼脂培养基：蔗糖140g， NH4NO3 2g， KH2PO4 2g， MgO4.7H2O 0.25g， FeCl3.6H2O 0.02g， MnSO4.4H2O 0.02g， 麦芽汁20ml， 琼脂20g， 用水定溶至1000ml。
米曲汁琼脂培养基：一份米曲加四倍质量的水，于55℃保温糖化3~4小时后煮沸，滤液用水调整浓度至10‘Bx，并用碱液将pH调制到6.0，接着添加琼脂2%。确认所制成的斜面无杂菌污染后，接入黑曲霉孢子悬液0.1ml，于32℃培养4~5d。
2) 种子扩大培养
① 二级扩大培养
a 培养基
有琼脂固体培养和液体表面培养两种方法，前者的培养基组成与斜面培养基相同，后者的组成如下：
麦芽汁70BX， 氯化铵2%， 尿素0.1%，
b 培养
固体培养时，500ml茄子瓶装80ml琼脂培养基，250茄子瓶装50ml琼脂培养基。灭菌后摆成斜面，凝固后的斜面至37℃下培养24h。确认无杂菌污染即可使用。
液体培养时，将液体培养基装入三角瓶中，使液层深度达45cm，于0.1MPa下湿热灭菌15min。按无菌操作接种。培养温度32℃。液体表面需7~10d，琼脂固体培养需6~7d。
② 三级扩大培养
可采用麸曲固定培养、液体表面培养或琼脂固定培养。
所用培养基如下：
a 麸曲培养基：
新鲜小麦麸皮1kg，加水1.1~1.3L。液体培养基与第二级扩大培养基所用液体培养基相同。
b琼脂固体培养基：
与斜面培养基相同。
3） 发酵生产
① 工艺流程
以薯干粉为原料的液体深层发酵工艺流程：
斜面菌种→麸曲瓶→种子
↓
薯干粉→调浆→灭菌(间歇或连续式)→冷却→发酵→发酵液→提取→成品
↑
无菌空气
以薯渣为原料的固体发酵工艺流程：
试管斜面→三角瓶菌种→种曲
↓
薯渣→粉碎→蒸煮→摊凉接种→装盘→发酵→出曲→提取→成品
↑
米糠
② 液体发酵
a不置换法
培养液一次加入，发酵结束后弃去菌盖，发酵液用来提取柠檬酸。具体操作是：接种后，培养温度维持在35℃，这是黑曲霉的适宜生长温度，需维持72h左右，以促进孢子发芽及菌体发育。当温度逐渐下降时，必须通人约50℃的空气以维持35℃的培养温度，通风量为3~5m3/m2.h。接种后20h左右可出现灰白色、很薄的菌膜，72h时菌膜已完全形成，菌膜相当厚且有皱褶。48h起由于菌体耗氧增加，可开动另一组风管向盘层之间通汽，进汽温度为40℃左右，风量为7m3/m2.h，进汽湿度为75%以上，以防培养液水分蒸发过快。自接种后72h起进入产酸期，这时菌体代谢速率高，耗糖快，发酵液酸度急剧升高，并释放出大量热，时可达1000kJ/(m2.h)，此时应加强通风措施，严格将发酵温度控制在26~28℃，以利柠檬酸的形成。因此，一般在进入产酸期前8h左右需增大风量至15~18m3/m2.h，且降低进汽温度在25℃以下，湿度仍在75%以上。160h以后发酵结束。
b 置换法
置换法一般是采用糖浓度低而营养较丰富的培养液先培养菌盖，待菌盖形成之后再更换发酵培养基。可更换1次也可数次，发酵液用来提取柠檬酸。培养菌盖，一般使用5%的糖液，视糖蜜质量再补充少量NH4NO3、K2HPO4等盐类。接种孢子后，室温保持在34~36℃，培养液品温为32~34℃，使孢子发芽，正常情况下40h即可形成紧密有皱的菌盖。菌盖形成后，放掉培养基，更换发酵培养基(即第1次置换)，并将室温降至30~32℃，待发酵48~60h后再放掉发酵液，加入新培养液即进行第2次置换。如此重复，一般可置换培养基8~10次，总发酵周期为14~20d，收集起来的发酵液，用来提取柠檬酸。置换法的优点是节省了大量培菌时间，发酵速度’快，而且原本不适宜长菌的原料却可用作发酵培养基。但为了保持菌盖的高活性，因此不能将发酵液残糖控制得很低，这样一来就造成替换出来的发酵液其残糖量较高，给后道提取柠檬酸带来困难。
c 不置换法影响表面发酵的因素
a) 培养液层厚度
培养基液层厚度大，发酵产物总的生成量就大。如果原料质量好，预处理方法得当，曲霉菌丝体活力强，那末可适当增加液层厚度;相反，就应减少液层厚度。
b) 糖浓度
用于表面发酵的糖蜜浓度，质优的糖蜜浓度(以蔗糖浓度计)为18%~22%较适宜，而质劣的糖蜜一般采用14%。在表面发酵中，大约80%的糖被用于合成柠檬酸，菌体生长增殖耗糖8%左右，菌体进行呼吸消耗的糖在10%左右，另有1%~2%的糖用于合成副产物。
c) 温度
黑曲霉适宜产酸温度是26~28℃。温度高，容易形成杂酸等副产物且菌体易衰老；温度低，发酵周期被延长。
d) pH值
黑曲霉长菌的适pH为中性，而产酸的适pH在2.5~2.0。因此，应该注意的是：菌盖形成之后，只是在菌盖下面有一个低PH区域，菌体合成柠檬酸的活动都是在这低pH区域内进行的，所以不应该搅动发液，避免低值区域的pH值上升而长菌不产酸。
e) 通风
表面发酵是气相传氧，因此传氧效率较高，所以只要保持发酵室内有适当空气流通就可以满足霉菌对氧的需要。较高度的CO2会影响菌体的生长和降低产酸能力。一般将CO2控制在3%以下即可。
② 固体发酵
a 浅盘发酵
将曲置于曲室内培养，室温可按需要调节。在孢子发芽和菌丝生长期，由于产生的热量少，品温会逐渐下降，在入室后自18h内，应维持品温在27~31℃。培养18~48h期间，由于发酵热的大量释放，品温上升很快，应采取措施，不得让品温超过43℃，因为菌体活力下降，所以品温会下降，此时应维持在35℃左右，直至发酵结束。为了克服上、下曲盘的温差，在发酵40h左右时应将曲盘上下对调。整个发酵期间不必翻曲。曲室相对湿度在85%~90%。发酵终点根据酸度来判定，从48h开始测量酸度，以后每隔12h测定1次，自72h以后则每隔4h测定1次，在酸度达到时即出料，否则时间延长，柠檬酸反而被菌体消化。
b 厚层通风发酵
与浅盘发酵明显不同的是，在物料铺摊厚度上，厚层发酵的曲醅厚度在50cm左右，比浅盘发酵的15~20cm要大出许多。为了给曲霉菌提供氧，在培养过程中需要进行机械通风。培养过程中的温度控制与浅盘发酵的温度管理相似，但品温不能超过40℃。温度和湿度主要靠通风来调节，因为物料厚度大，所以培养过程中需要翻料。厚层发酵比浅盘发酵优越之处在于：占地面积少，污染杂菌可能性小，机械化程度高。